科研丨Chemosphere: 二十种农药对土壤碳微生物功能和群落组成的影响
本研究在3种明显差异的农业土壤中研究了20种商用农药对土壤碳循环参数的影响。
已知农药会影响非目标土壤微生物。然而，比较多种农药对与碳循环相关的广泛微生物终点的影响的研究很少。本研究使用荧光酶法和实时PCR方法来评估20种商用农药(推荐剂量和5倍推荐剂量)对三种不同的南澳大利亚农业土壤中土壤碳循环相关酶活性(α-1,4-葡萄糖苷酶、β-1,4-葡萄糖苷酶、β-D-纤维素生物水解酶和β-木糖苷酶)以及功能基因(cbhl和chiA)绝对丰度的影响。在选定的农药处理样品和未处理样品中使用鸟枪法宏基因组测序确定农药对纤维素分解和几丁质分解微生物的影响以及总微生物群落组成。施用杀虫剂明显地增加了酸性土壤中cbhl和chiA基因的绝对丰度。在群落水平上，杀虫剂氟虫腈对纤维素分解和几丁质分解微生物的刺激作用最大，其次是杀菌剂甲霜灵-M和杀虫剂吡虫啉。在甲霜灵-M处理的土壤中观察到向真菌占主导地位的微生物群落的转变。总体而言，本研究根据结果得出，农药的施用可能会影响土壤碳循环，并可能破坏土壤有机质的形成和结构稳定。
土壤类型(Hart、Minnipa和Wolseley)、农药类别(杀虫剂、除草剂和杀菌剂)和剂量(单倍剂量施用和5倍剂量施用)的组合解释了碳循环相关微生物终点54.8%的变化(P=0.001，酶活性和绝对功能基因丰度)。土壤类型解释了大部分变异(方差=53.3%；P=0.001)，而农药类别(方差=1.12%；P0.01)和剂量(方差=0.40%；P0.05)相对低得多，但贡献仍然显著(表1)。
Wolseley土壤中农药类别和剂量之间的相互作用解释了最大限度的变异(18.2%)，其次是Hart和Minnipa土壤(分别为5.56%和2.46%)(表1)，这在某种程度上预示着与Hart和Minnipa土壤相比，Wolseley土壤受农药施用的影响更大(P=0.001)。在考虑农药种类和剂量对Wolseley土壤的个体效应时，农药类别(方差=11.6%；P=0.001)和剂量(方差=6.58%；P=0.001)对所有与碳循环相关的微生物终点都有显著影响(表1)。
鉴于我们在Wolseley土壤中发现的显著影响，个人会使用成对PERMANOVA进行了进一步的统计分析，以更好地了解哪些是这些影响的主要驱动因素。杀虫剂明显影响碳循环相关微生物终点(P0.05)(补充表S3)，这种影响是由cbhl和chiA基因丰度的变化驱动的(P0.05)(补充表S4)。在Wolseley土壤中考虑剂量效应时，与单倍剂量施用和未处理的土壤样品相比，5倍剂量施用对整体碳循环相关微生物终点的影响更大(P0.05)，其中chiA基因的丰度影响显著因(补充表S3和S5)。基于土壤类型(Hart、Minnipa和土壤)、农药类别(杀菌剂、除草剂和杀虫剂)和农药剂量(推荐剂量和5倍推荐剂量)，使用PERMANOVA与相关P值分析所有测试碳循环相关微生物功能标记的农药影响。
由于Wolseley土壤中cbhl和chia基因的绝对丰度受到农药施用的显著影响，咱们进行了进一步的统计分析以更好地了解单个农药对这两个基因的影响(图1)。两种基因的熔解曲线所示的所有测试样品的相似峰表明所进行的qPCR检测效率良好(补充图S2)。我们的ANOVA和Dunnett事后检验支持Pairwise-Permanova检验结果，即农药明显地增加了cbhl和chiA基因的绝对丰度。我们观察到，在两种剂量下用20种农药处理的样本中目标基因的绝对丰度没有明显降低(P0.05)(补充图S3)。相反，4种杀虫剂中的3种(α-氯氰菊酯、毒死蜱和吡虫啉)在5倍剂量施用下刺激了chiA和cbhl基因的丰度(图1)。从所测试的杀菌剂中，粉唑醇和嘧菌酯在5倍剂量施用时明显地增加了cbhl基因的丰度，而后者在单倍剂量施用时也表现出显著的刺激。最后，从所测试的除草剂中，氯磺隆在5倍剂量施用时刺激了chiA的丰度(图1)。
20种农药对Wolseley土壤中(a)cbhl和(b) chiA基因丰度的影响。直线代表对照(未经处理的土壤样品)的平均值，而虚线代表平均值的标准误差。*表示基因丰度与对照显著不同，P0.05；**P0.01；***P0.001。RD：推荐剂量；5RD：5倍推荐剂量。cbhl，纤维素酶；chiA，几丁质酶。
3.选定农药对Wolseley土壤纤维素酶和几丁质酶相关活性及微生物的影响
基于功能微生物终点的结果，我们最终选择了用除草剂(异丙甲草胺)、杀菌剂(甲霜灵-M和嘧菌酯)和杀虫剂(吡虫啉、氟虫腈和α-氯氰菊酯)处理的样品，5倍剂量施用和未处理的土壤样品，并使用散弹枪宏基因组测序分析了它们的微生物功能代谢潜力。选择三种杀虫剂和杀真菌剂嘧菌酯是基于它们对cbhl和chia基因丰度的显著刺激作用，而选择显示可忽略效应的除草剂异丙甲草胺和杀真菌剂甲霜灵-M与先前选择的农药作比较并代表我们评估中的所有农药类别(杀虫剂、除草剂和杀真菌剂)。
在所有农药处理的样品中，与未处理对照样品相比，我们注意到几丁质酶和纤维素酶相关活性的绝对丰度更高。氟虫腈处理的样品几丁质酶和纤维素酶相关活性最高，其次是用杀虫剂吡虫啉和杀菌剂甲霜灵-M处理的样品。与其他农药处理的样品相比，用杀虫剂α-氯氰菊酯、除草剂异丙甲草胺和杀真菌剂嘧菌酯处理的样品具有最低丰度的纤维素酶和几丁质酶相关活性(图2)。
然后我们确定了6种农药对所选纤维素分解和几丁质分解相关微生物的影响。先前的文献也从已知的纤维素分解和几丁质分解活性中选择了这些微生物，我们的结果为了这些微生物(在属水平)与几丁质酶和纤维素酶相关活性的强相关性(补充图S4-S5)。农药对这些选定的纤维素分解和几丁质分解微生物的影响与农药对几丁质酶和纤维素酶相关活性的影响相似。与未处理的样品相比，所有经农药处理的样品显示出更大的所选纤维素分解和几丁质分解微生物的绝对丰度(图3)。氟虫腈处理的样品显示出纤维素分解和几丁质分解微生物的最高丰度，随后是用甲霜灵-M和吡虫啉处理的样品，而用杀虫剂α-氯氰菊酯、除草剂异丙甲草胺和杀真菌剂嘧菌酯处理的样品中纤维素分解和几丁质分解微生物的丰度最低。在甲霜灵-M处理的样品中，与细菌群落相比，观察到了更为丰富的纤维素分解和几丁质分解线种选定的农药处理土壤样品和未处理土壤样品(对照)中，微生物相关几丁质酶和纤维素酶活性的绝对丰度热图(蓝色到红色)。每个样品的农药类别由左侧的绿-粉-蓝-紫一栏表示。使用平均连锁算法对微生物相关活性进行分层聚类。
在6种选定的农药处理样品和未处理样品(对照)中，文献中已知的(a)纤维素分解和(b)几丁质分解微生物在属水平上的绝对丰度热图。每个样品的农药类别由左侧的绿-粉-蓝-紫一栏表示。使用平均连锁算法对微生物群进行分层聚类。
基于宏基因组数据集，我们确定了Wolseley土壤中细菌和真核微生物群落的组成。细菌在土壤宏基因组中占主导地位，占整个微生物群落的98%，而线%。在分析的所有样品中，酸杆菌门、放线菌门、拟杆菌门、绿弯菌门、蓝藻门、厚壁菌门、浮霉菌门、变形菌门和疣微菌门是主要的细菌门，其中放线菌门和变形菌门占总细菌丰度的35%以上(补充图S6)。对于真核生物，Apicomplexa、Arthropoda、子囊菌门、Bacillariophyta、担子菌门、Chlorophyta、Chordata、Cnidaria、Nematoda和Streptophyta是优势门，其中子囊菌门几乎占土壤真核微生物群落的一半(补充图S7)。然后，我们在1%的临界值水平(属水平)上测定了农药对优势微生物的影响。总体而言，用所选农药处理的土壤样品中优势微生物(属水平)的绝对丰度大于未处理的土壤样品(图4)。
氟虫腈处理的样品中优势细菌和真核生物的绝对丰度最高，而用杀虫剂α-氯氰菊酯、除草剂异丙甲草胺和杀真菌剂嘧菌酯处理的土壤样品中优势细菌和真核生物的绝对丰度最低。与α-氯氰菊酯、异丙甲草胺和嘧菌酯相比，用吡虫啉和甲霜灵-M处理的土壤样品中，大多数高丰度微生物的绝对丰度都更高，这对于一些真核微生物来说越来越明显，尤其是吡虫啉处理样品中的Pyrenophora、Phaeosphaeria、Neurospora和Xenopus，甲霜灵-M处理样品中的Neurospora、Chaetomium、Podospora和青霉属(Penicillium)(图4)。
在6种选定的农药处理样品和未处理样品(对照)中，在1%临界水平(属水平)下，细菌和真核生物样本中每种微生物的绝对丰度热图。每个样品的农药类别由左侧的绿-粉-蓝-紫一栏表示。使用平均连锁算法对样品和微生物进行分层聚类。
农药对土壤碳循环的影响受到许多环境和非生物土壤因素(例如粘土含量)以及农药特性的影响。本研究调查了土壤类型、农药种类和农药施用量对碳循环相关微生物终点的影响，发现土壤类型是农药作用的主要决定因素。三种土壤之间的主要不同之处在于它们的pH值，Hart (pH 8.4)和Minnipa (pH 8.8)土壤是碱性的，而Wolseley(pH 5.4)土壤是酸性的。过去的研究表明，土壤pH值是强烈影响农药土壤吸附的因素之一。对Wolseley土壤中cbhl和chiA基因绝对丰度表现出刺激作用的农药大多是非离子性的，例如杀虫剂毒死蜱、氟虫腈、吡虫啉和α-氯氰菊酯和杀真菌剂嘧菌酯，而除草剂氯磺隆和杀菌剂粉唑醇为弱酸，解离常数(pKa)分别为3.4和2.3。以前的研究报道，非离子性毒死蜱在酸性土壤中具有更大的吸附亲和力，这归因于其在低pH值土壤中的临时极化作用。酸性农药与低pH值土壤中农药吸附之间也存在正相关关系。这可能归因于酸性农药随着pH值降低而变得质子化的趋势，以此来降低了土壤颗粒和解离的农药之间的排斥力。在我们的研究中，这些农药更强的吸附能力可能降低了它们的不利影响，但对cbhl和chiA基因丰度的刺激作用要进一步分析。
除土壤理化特性外，不同农药类别的农药效应也存在一定的差异，农药施用对cbhl和chiA基因丰度具有一致且显著的正向效应(P0.05)。有必要注意一下的是，农药的广泛使用已使土壤微生物发展出降解农药的能力。据报道，各种细菌和真菌菌株可通过农药，如Acinetobacter、Bacillus、Flavobacterium、Pseudomonas、Streptomyces、Aspergillus和Trichoderma，特别是以杀虫剂作为碳源。然而，微生物同化杀虫剂作为能源的能力并不限于杀虫剂。杀虫剂对纤维素酶活性的刺激作用可能与其作用方式有关，要进一步研究。农药对土壤碳微生物功能的影响也呈剂量依赖性(P0.01)，施用剂量越高，观察到的对cbhl和chiA基因丰度的刺激作用越大。我们的结果与先前的研究结果一致，这些研究结果也证明了当杀虫剂和杀菌剂应用于土壤时对微生物生长和酶活性的显著刺激作用。Gundi等人研究表明，以高达25 μg·g-1的剂量施用杀虫剂久效磷、喹硫磷和氯氰菊酯可明显地增加总微生物种群的丰度和纤维素酶活性。因此，农药剂量对土壤微生物功能的影响可能取决于所用农药/活性成分的活性和特异性。此外，农药对土壤微生物功能的影响与土壤类型、农药种类和农药剂量紧密关联。我们之前的工作研究了相同的20种农药施用于相同的三种土壤时对氮循环的影响。总体而言，与当前研究中观察到的以刺激作用为主的C循环相比，农药对N循环终点的抑制作用明显更大。例如，杀虫剂氟虫腈抑制了碱性壤土Hart土壤中的 β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性和潜在的硝化作用，但却刺激了酸性沙壤土Wolseley土壤中的纤维素分解和几丁质分解微生物。这突出了在每项研究中纳入多个测试参数的重要性。
碳的微生物降解由一组极其多样化的微生物进行，并且它涉及广泛的酶，其本身以高基因型多样性为特征。虽然大多数农药对土壤碳微生物功能的影响最小，但我们确定cbhl和chiA绝对基因丰度是对农药施用最敏感的标记。六种农药对Wolseley土壤中的chiA和cbhl绝对基因丰度均有显著刺激作用，而农药对AG、BG、CB和XYL酶活性的影响可忽略不计。酶活性和基因丰度之间的明显差异主要是由于在每个微生物终点中测量的不一样的属性；AG、BG、CB和XYL活性估计微生物在碳降解中的功能，而cbhl和chiA基因绝对丰度定量真菌CBH和A族几丁质酶。cbhl和chiA基因对农药暴露的更高敏感性可能是由于真菌群落和链霉菌对多糖降解的更高潜力，以及应对环境变化的更快响应，特别是农药应用碳源的波动。尽管经常报道农药对土壤酶活性的负面影响，Riah-Anglet等人表明AG、BG、CB和XYL对杀菌剂处理不是高度敏感，这支持了我们的研究结果。因此，将酶活性和基因丰度作为微生物参数，对于更全面地了解农药对土壤碳循环中微生物活性的影响具备极其重大意义。
由于关于细菌和真菌在不稳定和顽固碳分解中的作用研究存在相反的结论，因此将分类学与微生物功能联系起来对于评估参与碳循环的微生物群落对农药应用的响应很重要。据文献报道，细菌属Bacillus、Paenibacillus、链霉菌属和真菌属曲霉属、青霉属、Hypocrea和Chaetomium globosum在纤维素和几丁质催化活性方面都具有潜力。几丁质和纤维素被报道为结构同源物，事实上，大多数碳源显示出高基因组内冗余。因此，每种微生物菌株都可能具有降解纤维素、几丁质及其它碳源的特性。在我们的研究中，在用所选农药处理的酸性土壤样品中，所有这些微生物以及之前报道的其它纤维素分解和几丁质分解微生物均与微生物相关纤维素酶和几丁质酶活性呈正相关。除了这些功能特定的分类群之外，我们还进一步研究了所选农药对高丰度细菌和真核生物属的影响，以防止观察到的农药对微生物群落的影响可能是由于功能冗余造成的。我们的根据结果得出，与对照土壤相比，所有六种农药处理的酸性土壤中微生物丰度总体上有所增加。有必要注意一下的是，杀虫剂氟虫腈、α-氯氰菊酯和吡虫啉已被公认为许多土壤微生物的碳源和能源，并且一些研究报告了用这些杀虫剂处理的土壤中总微生物群落增加。总微生物群落的增加进一步证明了碳循环是由各种非专业微生物驱动的，这与由功能微生物群落执驱动的氮循环不同。
在本研究中观察到，与细菌相比，杀菌剂甲霜灵-M的作用下微生物群落向真菌转移，真菌的丰度更高，特别是纤维素分解和几丁质分解真菌，如Hypocrea、Penicillium、Aspergillus和Chaetomium，以及高度丰富的真核生物Neurospora和Podospora。虽然不知道Neurospora和Podospora的纤维素分解或几丁质分解能力，但据报道，其在果胶和木质素同化中至关重要。真菌群落的大幅度的增加与Wakelin等人先前进行的研究结果一致，它们报告了真菌(镰刀菌)对甲霜灵-M的适应性更强，其在甲霜灵-M处理土壤中的相对丰度明显地增加。这可能是由于甲霜灵-M对致病性真菌的抑制作用，或由于其大范围的使用在控制疫霉菌和其它卵菌而在真菌群落中产生了甲霜灵-M抗性。
虽然这项研究在三种不同的土壤类型中测试了范围广泛的农药，但任旧存在一些限制。测试的每类农药的数量不均匀。在本研究中测试的除草剂多于杀虫剂或杀菌剂，因为除草剂是最大的农药产品组，占澳大利亚农业农药年销售额的50%以上。然而，该研究的目的是确定具有不一样作用模式的农药之间是不是存在显著差异，这是通过当前的实验设计实现的。虽然本研究中使用的三种南澳大利亚农业土壤具有不一样的土壤质地、养分含量和土壤pH值，但结论并不一定适用于所有土壤类型。因此，在更广泛的土壤类型中进行这些实验将是有益的，因为土壤特性强烈影响农药对土壤微生物功能的潜在负面影响。
本研究在3种明显差异的农业土壤中研究了20种商用农药对土壤碳循环参数的影响。cbhl和chiA基因丰度是农药施用最敏感的微生物终点。未观察到任何农药对与碳循环相关的功能微生物终点的负面影响。相反，我们注意到农药的刺激作用与土壤类型，特别是土壤pH值、农药组和农药剂量相关。对所选农药处理和未处理的酸性土壤样品的鸟枪法宏基因组分析表明，施用杀虫剂氟虫腈、吡虫啉、α-氯氰菊酯、杀菌剂甲霜灵-M、嘧菌酯和除草剂异丙甲草胺对微生物群落的总体刺激。然而，施用甲霜灵-M的刺激有利于微生物群落向真菌群落的的转变，这对土壤有机质形成有潜在的不利影响。综上所述，本研究结果支持所有三个假设，即农药对土壤碳循环的影响(i)因土壤类型和农药类别而异，(ii)是剂量依赖性的，(iii)导致微生物群落组成发生明显的变化。本研究还表明，农药的施用可能会影响土壤碳循环，并可能破坏土壤有机质的形成和结构稳定。此外，本研究结果为评估农药对SOM降解和形成以及碳循环的影响提供了新的见解。